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ELISA中Z的酶和底物
更新時(shí)間:2015-06-17   點(diǎn)擊次數(shù):1261次


酶和底物  在ELISA中zui常用的酶為HRP和ALP。

    (1)HRP:是一種糖蛋白,含糖量約18%,分子量為44kD,在蔬菜作物辣根中含量很高。HRP是一種復(fù)合酶,由主酶(酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅素) 結(jié)合形成一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為五色糖蛋白,在275nm波長(zhǎng)處有zui高吸收峰;輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán),是酶的活性基團(tuán),在403nm波長(zhǎng)處有zui高吸收峰。HRP的純度用純度值(reinhartzahl,RZ)表示,RZ=A403nm/A275nm,即403nm的吸光度與280nm的吸光度之比,高純度HRP的RZ值應(yīng)≥3.0。HRP質(zhì)量的另一重要指標(biāo)是酶活力,以單位(unit,U)表示。用于標(biāo)記的HRP比活性應(yīng)≥250U/mg。HRP的作用底物為H202,催化下列反應(yīng);
DH2+H202  HRP  D+2H2O

   上式中DH2為供氫體(即底物),H2O2為受氫體。HRP對(duì)受氫體的專(zhuān)一性很高,除H2O2外,僅作用于小分子醇和尿素的過(guò)氧化物。HRP的底物有多種,在ELISA中常用的有:鄰苯二胺(orthophenylenediamine,OPD),四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5- tetramethyl-benzidine,TMB)和2,2,-連氮基-雙-3-乙基苯噻唑啉磺酸鹽[2,2,-azino-bisc(3- ethyl-benzthiazolinesulfonate-6),ABTS]。三者各有優(yōu)缺點(diǎn):OPD是在ELISA中應(yīng)用zui多的底物,靈敏度高,比色方便,但配成溶液后穩(wěn)定性差,且有致異變性;TMB經(jīng)酶作用后由五色變藍(lán)色,加酸終止反應(yīng)后顯黃色,目測(cè)對(duì)比鮮明,可比色定量,溶液的穩(wěn)定性也較差,但無(wú)致異變性,因此應(yīng)用日見(jiàn)增多;ABTS雖然靈敏度不如OPD和TMB,但空白值很低。
   

   (2)ALP:是一種磷酸酯的水解酶,用做示蹤酶的ALP活性應(yīng)在l 000U/mg以上。ALP常用的底物為對(duì)硝基苯磷酸鹽(PNP),降解產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚。經(jīng)NaOH終止酶反應(yīng)后,顏色維持比較穩(wěn)定。
ELISA中酶作用于底物后生成有色物質(zhì)、熒光物質(zhì)或?qū)е禄瘜W(xué)發(fā)光,分別可用分光光度計(jì)、熒光光度計(jì)測(cè)量及照度計(jì)測(cè)量。熒光和化學(xué)發(fā)光測(cè)定的敏感度均高于比色測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍亦較比色反應(yīng)寬,測(cè)定效果優(yōu)于常用的比色ELISA。

 

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